B ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემიის უჯრედული ხაზის MEC1 უჯრედებში სპეციფიური სტიმულაციით გამოწვეული საპასუხო რეაქციის შესწავლა

ავტორი: რუსუდან ჭანკოტაძე
საკვანძო სიტყვები: ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემია, CD180, Toll–მსგავსი რეცეპტორები
ანოტაცია:

ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემია (ქლლ) - ლეიკემიის ყველაზე გავრცელებული ფორმაა დასავლეთის ქვეყნებში. დაავადება ძირითადად 50 წლის შემდეგ ვლინდება. ქლლ უჯრედები წარმოადგენენ მომწიფებულ, იმუნოკომპეტენტურ ლიმფოციტებს. B-ქლლ ერთადერთია ლეიკემიებს შორის, რომლის განვითარებაც არაა დაკავშირებული რადიაციული გამოსხივების, ქიმიური აგენტებისა და მედიკამენტების ზემოქმედებასთან. ქლლ უჯრედები წარმოადგენენ CD5+CD23+CD19+ CD40+ ლიმფოციტებს, მათ ზედაპირზე სხვა ზედაპირული მოლეკულების ექსპრესია მეტად ცვალებადია( მაგ., IgM, CD79a, CD79b-ს, CD20- ის და CD38-ის). იმუნოგლობულინის (Ig) მძიმე ჯაჭვის (H) (IGHV) არამუტირებული და მუტირებული გენების მიხედვით ქლლ კლონებს ყოფენ ორ ძირითად ქვეჯგუფად შესაბამისად დაავადების აგრესიული და დადებითი პროგნოზით. ნაჩვენები იქნა, რომ Toll-მსგავს რეცეპტორების ოჯახის წევრი - CD180/RP105 ჰეტეროგენულად არის ექპრესირებული ქლლ უჯრედებზე, ძირითადად კი - მუტირებული IGHV გენების მქონე უჯრედებზე. ასევე დადგინდა CD180-ის მონაწილეობა პრო-გადარჩენის პროცესებში ქლლ უჯრედებში და ასევე ის, რომ CD180 იყენებს იგივე ფოსფოინოზიტოლ-3-კინაზის (PI3K) სასიგნალო გზას, რაც B უჯრედული რეცეპტორი (BCR). მონოკლონური ანტისხეულებით CD180-ის შებოჭვა განაპირობებს CD180+ B-ქლლ კლონების დაახლოებით 50%-ის პროლიფერაციას, აქტივაციას და აპოპტოზისგან გადარჩენას, რის საფუძველზე მოხდა დაყოფა ე.წ. “მორეაგირე” და “არამორეაგირე” ქლლ კლონებად. აღსანიშნავია, რომ ქლლ პაციენტებში პროლიფერაცია მიმდინარეობს მხოლოდ ე.წ. „პროლიფერაციულ ცენტრებში“ - ლიმფურ კვანძებსა და ძვლის ტვინში, ხოლო პერიფერიული სისხლიდან გამოყოფილი ლიფოციტები გაჩერებულნი არიან უჯრედული ციკლის G0 ფაზაში. აღნიშნული ფაქტი განაპირობებს იმას, რომ პაციენტების სისხლიდან მიღებულ უჯრედებზე მუშაობისას, შეუძლებელია აქტიურად პროლიფერირებადი პოპულაციის მიღება ციტოკინების დამატების გარეშე და კვლევა იზღუდება უჯრედული ციკლის G0 ფაზაში გაჩერებული მცირე ზომის ლიმფოციტების პოპულაციით. შესაბამისად, ზემოხსენებული შეზღუდვის აცილების მიზნით, კვლევისთვის გამოვიყენეთ სამოდელო სისტემა - მუტირებული IGHV გენების მქონე ქლლ პაციენტის ლიმფოციტებისგან მიღებული უჯრედული ხაზი MEC1, რათა მოგვეცეს საშუალება აქტიურად ციკლირებად უჯრედების პოპულაციაზე, შევისწავლოთ სპეციფიური სტიმულაციის გავლენა სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნების და პროლიფერაციულ მექანიზმებზე. ჩვენმა კვლევითმა ჯგუფმა იქამდე შეისწავლა CD180-ის ექსპრესიის სტაბილურობა უჯრედული ციკლის ფაზების გავლისას, უჯრედების აქტივაციის ხარისხთან მიმართებაში. ნაჩვენები იქნა, რომ MEC1 უჯრედების აქტივაციის ხარისხი მატულობს უჯრედული ციკლის სტაბილიზაციის ფონზე, ასევე პირველად დადგინდა, რომ CD180-მაექსპრესირებელი უჯრედების პროცენტი პროლიფერებად ქლლ კულტურაში არ არის სტაბილური: CD180-მაექსპრესირებელი უჯრედების რაოდენობის მომატება შეიმჩნეოდა პოპულაციის ლოგარითმული ზრდის ფონზე გადათესვიდან პირველი 72 საათის განმავლობაში. ამგვარად, CD180-ის ექსპრესიის უჯრედების პროლიფერაციულ სტატუსთან დამოკიდებულების შემდგომი შესწავლის მიზნით, მოცემული ნაშრომის ფარგლებში შევისწავლეთ ზედაპირული IgM-ის ან/და CD180-ის შებოჭვის შემდგომ უჯრედული ციკლის ფაზებში უჯრედების პროცენტული გადანაწილების სურათი, შევაფასეთ აპოპტოზური MEC1 უჯრედების პროცენტული მაჩვენებელი და უჯრედების აქტივაციური სტატუსი. კვლევა სამ ამოცანად დაიყო: 1. MEC1 უჯრედებში IgM-ის შებოჭვის ეფექტის შესწავლა; 2. IgM-ის სასიგნალო გზის აქტივაციის გავლენის შეფასება CD180-ის ექსპრესიაზე; 3. სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნების და პროლიფერაციულ მექანიზმებზე IgM-ის ან/და CD180-ის შებოჭვის ეფექტის შედარება. სტიმულაციის საპასუხოდ უჯრედების პროლიფერაციული სტატუსის შესაფასებლად, ეთიდიუმ ბრომიდით ორმაგჯაჭვიანი დნმ-ის შეღებვის გზით, ვაკვირდებოდით უჯრედების გადანაწილების სურათს უჯრედული ციკლის ფაზებში. სიცოცხლისუნარიანობის შესაფასებლად, ვაკვირდებოდით, როგორც აპოპტოზის გვიან სტადიებზე მყოფი უჯრედების პროცენტულ მაჩვენებელს (ეთიდიუმ ბრომიდით შეღებვით მიღებულ სურათზე - ჰიპოპლოიდურ მონაკვეთი), ასევე ადრეული აპოპტოზის სტადიებზე მყოფი უჯრედების პროცენტობასაც: ფოსფატიდილსერინის ზედაპირული ექსპრესიის დადგენის გზით( გამოვიყენეთ ანექსინ V/ პროპიდიუმ იოდიდით ორმაგი შეღებვის მეთოდი). აქტივაციური სტატუსის შესაფასებლად ვაკვირდებოდით აქტივაციური მარკერის - CD38-ის ზედაპირულ ექსპრესიას. ყველა ჩამოთვლილი მეთოდის შემთხვევაში ნიმუშების ანალიზი ხდებოდა გამდინარე ციტომეტის გამოყენებით (FACScan, Becton Dickinson). კვლევის პირველ ეტაპზე IgM-ის შებოჭვის ეფექტი შევაფასეთ დროის მოკლე ვადაზე, ანუ სტიმულირების შემდგომ 0.5 საათში. რადგანაც, ცნობილია, რომ B უჯრედული რეცეპტორის შებოჭვის შედეგად საპასუხო რეაქცია სწრაფად ვითარდება. ვაფასებდით, როგორც პროლიფერაციის დონეს (უჯრედული ციკლის ფაზებში უჯრედების პროცენტული გადანაწილების სურათის მიხედვით), ასევე აქტივაციის ხარისხს აქტივაციური მარკერის CD38-ის ექსპრესიის მიხედვით და ადრეული აპოპტოზის დონეს ფოსფატიდილსერინის ზედაპირული ექსპრესიის შეფასების გზით. მიღებული შედეგების მიხედვით IgM-ის შებოჭვის საპასუხოდ ადგილი არ ჰქონდა არც პროლიფერაციას (G2/M ფაზაში: სპონტ. 2±0.6%; სტიმ.: 2.25±0.6%; S ფაზაში: სპონტ. 5±0.7%; სტიმ. 4.7±1.1% ), არც აქტივაციას (სპონტ.: 30.6±8.1% ; სტიმ.: 24.5±1.2% ) , არც აპოპტოზური უჯრედების პროცენტობის ცვლილებას (სპონტ.: 13.45±4.1% ; სტიმ. 9.83±3.9%). ამგვარად, დავადგინეთ, რომ MEC1 უჯრედები ანერგიულნი არიან B უჯრედული რეცეპტორის შებოჭვის მიმართ. აღნიშნული გვაძლევს საფუძველს, ჩავთვალოთ ეს უჯრედული ხაზი „არამორეაგირე“ ქლლ კლონის მოდელად. სამომავლო კვლევაში ამგვარი მოდელის გამოყენება დაგვეხმარება უკეთ შევისწავლოთ IgM-ის და CD180-ის სასიგნალო გზის/გზების ფუნქციური მდგომარეობა ანერგიის შემთხვევაში. B უჯრედული რეცეპტორის და CD180-ის ფუნქციური კავშირის შესწავლის მიზნით, ვაკვირდებოდით ასევე ზედაპირული IgM-ის შებოჭვის გავლენას CD180-ის ზედაპირულ ექსპრესიაზე. აღნიშნულ ეფექტს ვაფასებდით დროის სამ წერტილში: სტიმულირების შემდგომ 0.5, 6 და 24 საათში. მიუხედავად იმისა, რომ დროის მოკლე ვადებზე არ დაფიქსირდა სტატისტიკურად სარწმუნო განსხვავება სპონტანურ და სტიმულირებულ კულტურებს შორის (0.5სთ: სპონტ.-10.4±2.3სტიმ.-16.3±3.8; 6სთ: სპონტ.-28.2±8; სტიმ.-27±2), 24 საათისთვის დადგინდა CD180-ის მაექსპრესირებელი უჯრედების პროცენტული მაჩვენებლის დაქვეითება (სპონტ. : 29.5±5.2; სტიმ.: 15.5±3.5, p<0.05). რაც კიდევ ერთხელ ადასტურებს ფუნქციურ კავშირს CD180-ისა და B უჯრედულ რეცეპტორს შორის. რადგანაც აღნიშნული ეფექტი გამოვლინდა მხოლოდ 24 საათის შემდგომ, IgM-ის შებოჭვის ეფექტი შევაფასეთ მოგვიანებით ვადაზეც: სტიმულაციის 24 საათის შემდგომ. პარალელურად სტიმულაციას ვახდენდით როგორც ცალკე ანტი-CD180 მკა-ით, ასევე კომბინაციაში: ანტი- CD180 და ანტი- IgM მკა-ით ერთდროულად. მიღებული შედეგების მიხედვით ანტი- CD180 და ანტი- IgM მკა-ით მოქმედებისას დაფიქსირდა აპოპტოზისგან დაცვა (სპონტ.: % subG0=21±1.8; კომბ. სტიმ.: % subG0=12.5±2.8, p<0.05), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ MEC1 უჯრედების შემთხვევაში CD180-ის და ზედაპირული IgM-ის შებოჭვას სინერგისტული ეფექტი გააჩნია უჯრედების სიცოცხლისუნარუანობის შენარჩუნების სასიგნალო გზაზე. CD180-ის და B უჯრედული რეცეპტორის კავშირს შეიძლება ჰქონდეს დიდი მნიშვნელობა ქლლ-ის იმუნოპათოგენეზისთვის, რადგანაც ვარაუდობენ რომ ამ დაავადების განვითარებას ბიძგს აძლევს ჰიპოთეტური ჯერ-ჯერობით უცნობი ანტიგენი, ხოლო CD180, როგორც Toll-მსგავსი რეცეპტორების ოჯახის წევრი, ერთ-ერთი პირველი სავარაუდო რეცეპტორია, რომელმაც მონაწილეობა უნდა მიიღოს ამ პირველადი ანტიგენის ამოცნობაში. მაშასადამე CD180-ის და B უჯრედულ რეცეპტორის ურთიერთქმედების შესწავლა დაგვეხმარება უკეთ გავიგოთ ქლლ-ის ჩამოყალიბების მექანიზმები, რაც საშუალებას მოგვცემს მოვნახოთ სწორი გზა ამ დღესდღეობით განუკურნებელი დაავადებისთვის ახალი თერაპიული საშუალებების შემუშავებისთვის.

მიმაგრებული ფაილები:

B ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემიის უჯრედული ხაზის MEC1 უჯრედებში სპეციფიური სტიმულაციით გამოწვეული საპასუხო რეაქციის შესწავლა [ka]