B ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემიის უჯრედული ხაზის MEC1 უჯრედებში არასპეციფიური სტიმულაციით გამოწვეული საპასუხო რეაქციის შესწავლა

ავტორი: სალომე ოქრიაშვილი
საკვანძო სიტყვები: ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემია, Toll-მსგავსი რეცეპტორები, CD180
ანოტაცია:

ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემია (ქლლ) ხასიათდება CD5+CD19+CD23+ უჯრედების კლონური ექსპანსიით და აკუმულირებით ძვლის ტვინში, პერიფერიულ ლიმფურ ორგანოებსა და ქსოვილებში. იმუნოგლობულინის (Ig) მძიმე ჯაჭვის (H) (IGHV) არამუტირებული და მუტირებული გენების მიხედვით ქლლ კლონებს ყოფენ ორ ძირითად ქვეჯგუფად შესაბამისად დაავადების აგრესიული და დადებითი პროგნოზით. ნაჩვენებია, რომ ქლლ უჯრედები მიკროგარემოსგან ღებულობენ სიგნალებს, რომლებიც ხელს უწყობენ მათ დაყოფას, გადარჩენასა და ექსპანსიას in vivo. სავარაუდოთ, ქლლ-ის განვითარებას ბიძგს აძლევს ჰიპოთეტური ანტიგენი ან ანტიგენები. შესაბამისად, მეტად მნიშვნელოვანია როგორც ზემოაღნიშნული ანტიგენის იდენტიფიცირება, ასევე ქლლ-ის უჯრედებში არსებული პრო-გადარჩენის სასიგნალო გზების შესწავლა. სავარაუდოთ, ერთ-ერთი რეცეპტორი რომელიც ურთიერთქმედებს მიკროგარემოსთან - Toll-მსგავს რეცეპტორების ოჯახის წევრი - CD180. ნაჩვენები იქნა, რომ CD180 ჰეტეროგენულად არის ექპრესირებული ქლლ უჯრედებზე, ძირითადად კი - მუტირებული IGHV გენების მქონე უჯრედებზე, ხოლო მონოკლონური ანტისხეულებით (მკა) CD180-ის შებოჭვა განაპირობებს CD180+ B-ქლლ კლონების დაახლოებით 50%-ის პროლიფერაციას, აქტივაციას და აპოპტოზისგან გადარჩენას, რის საფუძველზე მოხდა მათი დაყოფა ე.წ. “მორეაგირე” და “არამორეაგირე” ქლლ კლონებად. ქლლ უჯრედული ხაზი - MEC1 მიღებულ იქნა 1999 წელს ებშტეინ-ბარის ვირუსზე (EBV)-სეროპოზიტიული დაავადებულის პერიფერიული სისხლის ლიმფოციტებიდან. აღნიშნული უჯრედული ხაზი უკვე აღიარებულ მოდელს წარმოადგენს ქლლ-ის იმუნოპათოგენეზის შესასწავლად. აღსანიშნავია, რომ MEC1 უჯრედები მიღებულია მუტირებული IGHV გენების მქონე ქლლ პაციენტისგან (მუტირების ხარისხი - 94.6% ). ჩვენი კვლევითი ჯგუფის წინა მონაცემებით დადგინდა, რომ MEC1 უჯრედული ხაზი ანერგიულია B უჯრედული რეცეპტორის შებოჭვის მიმართ და შეიძლება განიხილოს, როგორც „არამორეაგირე“ ქლლ -ის კლონის მოდელი. მეორეს მხრივ. ჩვენმა ჯგუფმა ასევე აჩვენა, რომ MEC1 უჯრედებზე ხდება CD180-ის ექსპრესია და CD180-მაექსპრესირებელი უჯრედების პროცენტი არ არის სტაბილური: CD180-მაექსპრესირებელი უჯრედების რაოდენობის მომატება შეიმჩნევა პოპულაციის ლოგარითმული ზრდის ფონზე გადათესვიდან პირველი 72 საათის განმავლობაში. იმის გათვალისწინებით, რომ ანერგიული MEC1 უჯრედები პროლიფერირებენ არასპეციფიური სტიმულაციის - გადათესვის (საკვები არის გამოცვლის) საპასუხოდ, და ასევე იმის გათვალისწინებით, რომ ლიტერატურაში არსებული მონაცემებით, დაავადებულთა სისხლიდან გამოყოფილი „არამორეაგირე“ ქლლ კლონების შემთხვევაში ნაჩვენები იყო მიტოგენური სიგანალით უჯრედების აქტივაციის შესაძლებლობა, გადავწყვიტეთ გვეცადა MEC1 უჯრედების სტიმულაცია მიტოგენით, რათა გამოწვეული პროლიფერაციის პირობებში სავარაუდო მომატებული CD180-ის ექსპრესიის ფონზე, შევისწავლოთ ამ რეცეპტორის მონაწილეობა პრო-გადარჩენის სასიგნალო გზებში. ამგვარად, ჩვენი კვლევის მიზანს წარმოადგენდა არასპეციფიური სტიმულაციის ეფექტის შესწავლა MEC1 უჯრედებში. რისთვისაც გამოვიყენეთ ფართო სპექტრის მიტოგენი - ფორბოლ-მირისტატ აცეტატის (ფმა). აღნიშნული კვლევა ითვალისწინებდა ფმა-ით გამოწვეული სტიმულაციის ეფექტის შეფასებას და გულისხმობდა სტიმულაციის შემდგომ: 1. უჯრედების ფენოტიპურ პროფილის შესწავლას; 2. სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნების შეფასებას; 3. პროლიფერაციულ სტატუსის შესწავლას; 4. აქტივაციის ხარისხის შეფასებას. ასევე დამატებით (მე-5) ამოცანად დავისახეთ შევისწავლოთ ფენოტიპური პროფილის ცვალებადობა დროში სპონტანურ კულტურაში. CD180-ის შემთხვევაში, კვლევის წინა ეტაპზე, ჩვენ უკვე ნანახი გვქონდა 24 -144სთ ინტერვალში MEC1 უჯრედებში მისი ზედაპირული ექსპრესიის ცვალებადობა. კონტროლის სახით ვიყენებდით ექსპერიმენტულ ნიმუშთან ერთდროულად გადათესილ სპონტანურ კულტურას. დროის სხავადასხვა წერტილებში ვსაზღრავდით უჯრედების აპოპტოზის დონეს, პროლიფერაციის ხარისხს, აქტივაციური მარკერის CD38-ის ზედაპირულ ექსპრესიას, B უჯრედულ რეცეპტორთან ფუნქციურად დაკავშირებული რეცეპტორების - CD180-ის და CD32-ის ზედაპირულ ექსპრესიას. ზედაპირული მარკერების ექსპრესიას ვადგენდით ფლუოროქრომ-მონიშნული შესაბამისი მკა-ის გამოყენებით იმუნოფენოტიპირების მეთოდით და შემდგომი ანალიზით გამდინარე ციტომეტრზე ( FACScan, Becton Dickinson). სტიმულაციის საპასუხოდ უჯრედების პროლიფერაციული სტატუსის შესაფასებლად, ეთიდიუმ ბრომიდით ორმაგჯაჭვიანი დნმ-ის შეღებვის გზით, ვაკვირდებოდით უჯრედების გადანაწილების სურათს უჯრედული ციკლის ფაზებში. სიცოცხლისუნარიანობის შესაფასებლად, ვაკვირდებოდით, როგორც აპოპტოზის გვიან სტადიებზე მყოფი უჯრედების პროცენტულ მაჩვენებელს (ეთიდიუმ ბრომიდით შეღებვით მიღებულ სურათზე - ჰიპოპლოიდურ მონაკვეთი), ასევე ადრეული აპოპტოზის სტადიებზე მყოფი უჯრედების პროცენტობასაც: ფოსფატიდილსერინის ზედაპირული ექსპრესიის დადგენის გზით( გამოვიყენეთ ანექსინ V/ პროპიდიუმ იოდიდით ორმაგი შეღებვის მეთოდი). აქტივაციური სტატუსის შესაფასებლად ვაკვირდებოდით აქტივაციური მარკერის - CD38-ის ზედაპირულ ექსპრესიას. ყველა ჩამოთვლილი მეთოდის შემთხვევაში ნიმუშების ანალიზი ხდებოდა გამდინარე ციტომეტის გამოყენებით (FACScan, Becton Dickinson). მიღებული შედეგების თანახმად, უჯრედული კულტურის ზრდის 0.5 სთ-ზე აღინიშნებოდა CD180-ის ექსპრესიის მკვეთრი მომატება კონტროლთან შედარებით (CD180+ უჯრედების % სპონტანურ კულტურაში: 10.4±2.3, ფმა-სტიმულირებულ კულტურაში: 30.5±4.6, p<0.01), CD32-ის ექსპრესიის დონე უცვლელი რჩებოდა კონტროლთან შედარებით. პარალელურად, დადგინდა ფმა-სტიმულირებულ კულტურებში აპოპტოზის გვიან სტადიებზე მყოფი უჯრედების პროცენტობის მომატება კონტროლთან შედარებით (უჯრედების % subG0 ფაზაში: სპონტ. 15.25±3.9; სტიმ. 30.43±3.9, p<0.05). მეორეს მხრივ, აპოპტოზის ადრეულ სტადიებზე მყოფი უჯრედების პროცენტული მაჩვენებელი (რომელსაც ვადნედით ანექსინ V/პროპიდიუმ იოდიდით ორმაგი შეღებვის მეთოდით) მომატებული არ იყო, პირიქით, აღინიშნებოდა მისი დაკლების ტენდენცია კონტროლთან შედარებით (სპონტ. 13.5±4%; სტიმ. 3.31±1.4%). აღნიშნული წინააღმდეგობა აიხსნება იმით, რომ, როგორც ჩანს, მიტოგენის საპასუხოდ უჯრედების პოპულაციის ნაწილი განიცდის აქტივაციით-განპირობებულ კვდომას, რომელიც მეტად სწრაფად მიმდინარეობს, და სტიმულაციის 0.5 სთ-ის შემდეგ უკვე შეუძლებელია ამ უჯრედების იდენტიფიცირება აპოპტოზის ადრეული სტადიების დადგენის მეთოდით, რადგანაც ამ უჯრედებში დროის მოცემულ წერტილში უკვე დნმ-ის ფრაგმენტირება შეიმჩნევა, რომლის გამოვლენა შესაძლებელი აღმოჩნდა ეთიდიუმ ბრომიდით დნმ-ის შეღებვით. ამავე დროს, როგორც დადგინდა უჯრედული ციკლის ფაზებში უჯრედების გადანაწილების შესწავლისას, მიტოგენზე საპასუხოდ არ შეინიშნებოდა უჯრედების პროლიფერაციის მომატება (უჯრედების % S ფაზაში: სპონტ.5±0.7; სტიმ. 3.25±0.5; უჯრედების % G2/M ფაზაში: სპონტ. 2±0.6; სტიმ. 1.9±0.5). იმ დროს, როცა ჩვეულებრივად ნორმალური ლიმფოციტები ფმა-ით სტიმულაციაზე ინტენსიური პროლიფერაციით პასუხობენ. ასევე აღსანიშნავია, რომ ფმა-ით სტიმულაციის შემდგომ არ დაფიქსირდა აქტივაციური მარკერის CD38-ის ზედაპირულ ექსპრესიის მომატებაც კონტროლთან შედარებით (CD38+ უჯრედების % სპონტანურ კულტურაში: 30.6±8.1; სტიმ. 19.7±5.5 ), რაც ასევე არ შეესაბამება ნორმალური ლიმფოციტების შემთხვევაში ნაჩვენებ სურათს, როცა ფმა-ით სტიმულაციის შემდგომ ხდება მკვეთრი მომატება ყველა აქტივაციური მარკერის. სპონტანურ კულტურაში CD38-ის ექსპრესია მაქსიმალურ დონეს აღწევდა გადათესვიდან 0.5 სთ შემდგომ (30.6±8.1%), ხოლო დროის მოგვიანებით წერტილებში (24 სთ, 48სთ, 72 სთ, 96 სთ) კლებულობდა და 96 საათისთვის საბოლოოდ მხოლოდ 5%-ს შეადგენდა (5±0.01). სპონტანურ კულტურაში ასევე შესწავლილ იქნა CD180-ის ექსპრესიის პროფილი 0.5 -24 სთ ინტერვალში. დადგინდა, რომ CD180-ის ზედაპირული ექსპრესია გადათესვიდან 8 სთ-ის შემდეგ იწყებდა მომატებას( CD180+ უჯრედების %: 0.5 სთ - 10.4±2.3; 8სთ - 24.2±3.5, p<0.05) და აღწევდა მაქსიმუმს 24 საათისთვის (29.5±5.2, p<0.05). B უჯრედული რეცეპტორის სასიგნალო გზის ნეგატიური რეგულატორის - CD32-ის ზედაპირული ექსპრესია დროის ამ წერტილში, პირიქით დაბალი აღმოჩნდა (11±3.8%) და მაქსიმუმს აღწევდა გადათესვიდან 96 საათის შემდგომ (36±1.3% ). ამგვარად, მიღებული მონაცემების თანახმად, MEC1 უჯრედები სპონტანურ კულტურაშიც იმყოფებიან ნაწილობრივად აქტივირებულ მდგომარეობაში (CD38-ის მაექსპრესირებელი უჯრედების პროცენტი 30.6±8.1% აღწევს) და მიტოგენით სტიმულაციის საპასუხოდ ამ უჯრედებში ვითარდება არა მოსალოდნელი პროლიფერაცია/აქტივაცია, არამედ, პოპულაციის ნაწილი ე.წ. აქტივაციით-ინდუცირებული კვდომას განიცდის, უმეტესი ნაწილი კი ანერგიული რჩება მიტოგენური სიგნალის მიმართ. MEC1 უჯრედული ხაზი წარმოადგენს მუტირებული IGVH გენების მქონე „არამორეაგირე“ ქლლ კლონის მოდელს, ლიტერატურაში არსებული [Muzio et ai., 2008] მონაცემებით, დაავადებულთა სისხლიდან გამოყოფილი „არამორეაგირე“ ქლლ კლონების შემთხვევაში, ნაჩვენები იყო მიტოგენური სიგანალით უჯრედების აქტივაციის შესაძლებლობა, რადგანაც მიტოგენით გამოწვეული სტიმულაცია არ არის დამოკიდებული B უჯრედული რეცეპტორის სასიგნალო გზაზე. შესაბამისად, ჩვენი ვარაუდით, მსგავს სურათს ველოდბოდით MEC1 უჯრედებშიც, ამ დროს დადგინდა ამ უჯრედული ხაზის ანერგია მიტოგენური სტიმულის მიმართაც. აღსანიშნავია, რომ აღწერილი ანერგიის ფონზე, მიტოგენის საპასუხოდ გარკვეული დაგვიანებით (24 სთ-ში) შეინიშნებოდა ცვლილება რეცეპტორულ პროფილში, კერძოდ მკვეთრად მატულობდა CD180-ის ზედაპირული ექსპრესია. MEC1 უჯრედებში ნაჩვენები B უჯრედული რეცეპტორის ანერგიის და ასევე CD180-ის და B უჯრედული რეცეპტორის სასიგნალო გზების კავშირის გათვალისწინებით აღნიშნული ფაქტი მიუთითებს იმაზე, რომ ამ ორი რეცეპტორული კომპლექსის რეგულაცია ნაწილობრივად ერთმანეთისგან დამოუკიდებლად მიმდინარეობს. როგორც ზემოთ ავღნიშნეთ, MEC1 უჯრედული ხაზი წარმოადგენს მუტირებული IGVH გენბის მქონე „არამორეაგირე“ ქლლ კლონის მოდელს, შესაბამისად ამ მოდელისთვის ვაჩვენეთ, რომ გარე სტიმულს შეუძლია ამ „არამორეაგირე“ კლონში CD180-ის დონის მოდულირება. მიღებული მონაცემები დაგვეხმარება ქლლ „არამორეაგირე“ კლონების ანერგიის ფენომენის და ასევე ქლლ-ის პათოგენეზში CD180-ის როლის შესწავლაში.

მიმაგრებული ფაილები:

B ქრონიკული ლიმფოციტური ლეიკემიის უჯრედული ხაზის MEC1 უჯრედებში არასპეციფიური სტიმულაციით გამოწვეული საპასუხო რეაქციის შესწავლა [ka]